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血管新生とその阻害物質の評価
●2008年9月10日発行 （株）メルシャン クリンテック 受託試験部 【第27号】
いつも当社のメールマガジン「食品機能研究ニューズ」をご愛読いただき、ありがとうございます。今回は血管新生に関する情報と当社で確立しています実験モデル・鶏胚漿尿膜法（CAM法）とマウス背部皮下法（DAS法）をご紹介致します。2002年3月号（第2号）および2003年6月号（第7号）のメールマガジンで血管新生に関する話題提供を行いましたが、最近お客様よりこの分野の問合せが多いことより、その後の最新情報の紹介と当社の実験結果の紹介を含めた今回の特集を組みました。このメールマガジンの情報が皆様方の医薬品・機能性食品などの研究開発の参考になれば幸いです。
1. 血管新生とは
「人は血管とともに老いる」といわれますように、血管は心臓から全身に血液を送る通り道（パイプ）で、血液中の酸素、栄養分、ホルモンなどを全身に送る重要な役割を示しています。血管新生（angiogenesis）とは、既存の微小血管から新しい血管ネットワークが形成される現象のことです。
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血管新生のプロセスを図1に示しました。血管新生は、誘導因子と抑制因子のバランスによって調節されています。誘導因子の刺激が強くなると、(1)内皮細胞はプロテアーゼを産生して血管の基底膜を融解させ瘤（こぶ）状に突出します。(2)内皮細胞は間質の細胞外マトリックスを融解しながら遊走し、(3)後続の内皮細胞が増殖しながらこれに続いて芽を伸ばしていきます。(4)間質へと遊走した内皮細胞はやがて互いに接着してネットワークを形成し、外側に基底膜、内側に内腔を有する管腔構造を構築します。最後に、(5)周皮細胞（ペリサイト）がこれを取巻いて新しい血管が形成されます（佐藤，1997a）。
胎児における血管系の発生、すなわち胎生期の血管新生は重要な現象ですが、成熟個体における血管新生には以下に示す生理的な血管新生と病的な血管新生に分けることができ、この病的な血管新生の制御と治療が臨床的に重要です。細胞生物学、分子生物学の進展に伴って血管新生の分子機構に関する知見が集積されてきました。
2. 生理的血管新生と病的血管新生
生理的な血管新生は限られた部位で、しかも限られた時期にしか観察されない現象です。女性の子宮内膜と排卵後の卵胞における黄体形成の時に見られる血管新生が最も一般的です。その他、組織の発育過程、創傷時の肉芽形成などに見られるのが生理的な血管新生です。これらの血管新生は通常は抑制を受けていますが、必要な時と場所でのみ発現し、大部分が一過性でやがて退縮します（佐藤，1997a）。
一方、種々の病的状態で血管新生が観察されます。固形腫瘍（癌）、糖尿病性網膜症などの眼疾患、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患、尋常性乾癬などの皮膚疾患、粥状動脈硬化などが代表的疾患です。これらの病的な血管新生はそれぞれの病気と密接に関連しており、一般に病気が治癒しない限り退縮することはありません。慢性虚血状態における生体防御的反応としての副側血行路形成も血管新生の一種です（佐藤，1997a）。
3. 血管新生と病態
血管新生は種々の疾病と関連していますが、以下に体表的な疾病である固形腫瘍（癌）と関節リウマチの場合について詳しく解説致します。
3.1 腫瘍（癌）における血管新生
腫瘍細胞が惹起する血管新生を腫瘍血管新生（tumor angiogenesis）と言います。その機構は基本的には他の血管新生の場合と同じですが、その血管新生が生体制御機構の支配下になく無秩序なのが腫瘍血管新生の特徴です（及川，1995）。放射線や化学物質により正常細胞が変異を受けることで生体内に腫瘍細胞が生じ、秩序を失った異常な増殖を繰り返すことで腫瘍が形成されます。この腫瘍の増殖において、栄養分と酸素の供給、老廃物・代謝産物の排泄として血管が必須です（佐藤，1997b）。内皮細胞の産生するプロテアーゼが腫瘍組織の細胞外基質を消化して腫瘍細胞の分散を促し、転移を促進すると考えられています。また、内皮細胞の産生する増殖因子が腫瘍細胞の増殖や浸潤を促進するとされています（佐藤，1997b）。
3.2 慢性関節リウマチにおける血管新生
慢性関節リウマチは代表的な肉芽性腫性炎症疾患ですが、急性期から最小血管が増生することが知られています。この反応には炎症細胞から放出されるサイトカイン、増殖因子、ケミカルメディエーターが関与しており、これらの因子が内皮細胞に直接的、または間接的に作用して血管新生を惹起します。また、新生された血管の内皮細胞は、E-セレクチンなどの接着分子を高発現し、血球細胞の炎症部位への侵入を促進させ、炎症の進展や慢性化に関与しています（佐藤，1997c； 松原，1997）。
4. 血管新生阻害物質の評価方法
4.1 In vitro法
In vitro法としては、表1に示しますように内皮細胞による基底膜分解酵素産生に対する作用、基底膜分解酵素活性の抑制作用、内皮細胞増殖に対する抑制作用、内皮細胞遊走に対する抑制作用および内皮細胞による管腔形成に対する抑制作用などがあります。これらの試験方法の中で最も特異性が高い試験方法は内皮細胞の管腔形成に対する作用を調べる方法であると考えられています（及川，1995； 林、及川，1996）。
区分 |
血管新生阻害作用の評価方法 |
| In vitro法 | ▲ 内皮細胞の基底膜分解酵素産生に対する作用 |
| In vivo法 | ▲ 鶏胚漿尿膜（CAM）法 |
4.2 In vivo法
In vivo法としては、表1に示すように鶏胚漿尿膜法（chorioallantoic membrane assay 法、CAM法）、ウサギ角膜法、マウス背部皮下法（dorsal air sac 法、DAS法）などがあります。CAM法は、鶏胚の成長に伴い漿尿膜上で起る生理的な血管新生に対する阻害効果を調べるものであり、また局所効果を調べる方法です。被験物質量が少なくて済みますので、一次スクリーニングには適した方法です。CAM法で効果があった場合には次の評価方法として、DAS法を用いて腫瘍血管新生に対する被験物質の効果を全身投与で調べるのが良いと思います（及川，1995； 林、及川，1996）。ただ、私達はin vitro法またはCAM法（生理的血管新生）には全く影響を与えず、DAS法（腫瘍誘発性血管新生）にのみ抑制効果を示した物質も過去に経験しています（Oikawa et al，1997； Nakashima et al，1999）。
5. CAM法とDAS法の具体的結果紹介
5.1 CAM法の方法と結果
受精0日の鶏受精卵を購入後、気室を上にして5〜6日間、37℃で培養し漿尿膜の径が5mmになった時点で被験物質を添加しました。すなわち、気室上部の卵殻と卵殻膜を除去し、漿尿膜上にシリコンリングを置きました。リング内に被験物質を注入し、鶏卵上部をアルミキャップで覆い、さらに2日間培養しました。漿尿膜内に脂肪乳剤を注入後、実体顕微鏡下で漿尿膜上の血管網を観察しました（Oikawa et al，1997）。
漿尿膜上に径3mm以上の無血管領域が形成された場合を血管新生阻害作用がポジティブと判定しています。通常、試験結果はポジティブと判定された鶏卵の割合で表しますが、今回は対照卵（溶媒のみ添加）とアスコルビン酸（5 μmol/egg）添加卵の写真のみを図2-1および図2-2にご紹介します。アスコルビン酸の添加卵では無血管領域が形成されています。
 図2-1 対照卵（溶媒添加） |
 図2-2 アスコルビン酸添加卵（血管新生阻害+） |
5.2 DAS法の方法と結果
雌性ICR系マウス（SPF）を購入後、バリアシステム飼育室内の個別ケージに収容しました。腹水型で継代維持したマウスからSarcoma 180（S180）腫瘍細胞を含む腹水を採取し、PBS(−)で洗浄後、調製して腫瘍細胞を含む浮遊液を作製しました。この浮遊液をチャンバーに注入し、麻酔したマウスの背部皮下の空気嚢内に挿入後、切開部位を縫合しました。5日後に麻酔下のマウスより背部の皮膚が付着したチャンバーを摘出しました。チャンバー移植部位の皮膚の新生血管（長さ3mm以上でジグザグした形態）を実体顕微鏡で観察しました（Oikawa et al，1997； Nakashima et al，1999）。
この実験の場合も通常は評点（評点0：新生血管なし、評点1：新生血管1本、評点2：新生血管2本、評点3：新生血管3本以上）を付け、対照群（溶媒投与）の評点に対する被験物質投与群の評点を統計学的に解析して評価していますが、今回は写真(図3-1および図3-2)のみをご紹介します。
 図3-1 PBS(-)を注入（新生血管なし） |
 図3-2 S180腫瘍細胞を注入（新生血管あり） |
6. 最近の血管新生阻害物質の開発状況
病的な血管新生を引き起こす因子として、VEGF（vascular endotherial growth factor、血管内皮増殖因子）、血小板由来増殖因子（PDGF、platelet-derived growth factor）、アンジオポエチン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）などがあります。なかでもVEGFは血管新生の中心的役割を示しています。この10年の間に血管とリンパ管の新生を制御する分子に関する研究が著しく進展してきました（渋谷、2006）。
6.1 医薬品の開発状況
上記の世界的な血管研究を背景に、医薬品ではVEGFあるいはVEGF受容体を阻害して癌の血管新生を抑制する抗癌剤の開発が進んでいます。これらの薬剤は、(1)VEGF抗体、(2)可溶型VEGF受容体、(3)低分子キナーゼ阻害薬、(4)VEGF受容体抗体に分類されています。低分子化合物の受容体キナーゼ阻害薬の作用メカニズムは、キナーゼのATP結合領域に薬剤が結合し、受容体の活性化（リン酸化）を抑制することで、阻害活性を示すと考えられています（小山ら，2008）。現在多くの受容体キナーゼ阻害薬の臨床研究が進んでいますが、最近になって2つの薬剤、ソラフェニブ（sorafenib、商品名nexavar）およびスニチニブ（sunitinib、商品名sutent）が進行腎細胞癌の治療薬として米国で承認されました（中村，2006）。また、抗VEGF中和抗体としてベバシズマブ（bevacizumab、商品名アバスチン）が開発され、この薬剤が抗癌剤との併用で大腸癌に対する良好な成績を示したことから、米国で承認されています（有賀、戸井，2006）。さらに、最近の新しい研究ではVEGFの刺激によって血管内皮に発現誘導される遺伝子のcDNAマイクロアレイ法による網羅的解析を行った結果、血管新生を抑制する新規因子（生体に存在する内因性因子）として、vasohibinが見つかっています（佐藤，2006；佐藤，2007）。Vasohibinは血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成の抑制、角膜アッセイにおける血管新生阻害およびマウスに対する抗腫瘍性を示すことが報告されています（佐藤，2007）。
6.2 健康・機能性食品の開発状況
一方、健康・機能性食品としてフコイダン、サメ軟骨エキス、ローヤルゼリーおよびメシマコブなどが血管新生阻害作用を示すことが報告されています。これらの食品の作用は、血管内皮細胞の増殖抑制または管腔形成阻害などのin vitro評価レベルものや、マウスに対する抗腫瘍活性、ヒトを用いた臨床試験レベルのものなど様々です。健康・機能性食品領域においても、今後益々、分子生物学的なエビデンスの確立が必要だと思います。
7. 参考文献
有賀 智行，戸井 雅和（2006）：第13章 VEGF中和抗体と固形癌の治療，癌と血管新生の分子生物学（澁谷 正史 編），p141-147，南山堂，東京．
林 純子，及川 勉（1996）：�厳豐豹契玄存核 し豐豹契犬離瓮�ニズムと疾患（室田 誠逸，井藤 英樹 編），p255-266， 医薬ジャーナル社，東京．
松原 司（1997）：4 炎症と血管新生，第3章 血管新生と病態， 血管新生学（佐藤 靖史 編），p147-157，メディカルビュー社，東京．
中村 一英（2006）：第15章 低分子血管新生阻害剤開発の現状，癌と血管新生の分子生物学（澁谷 正史 編），p159-167，南山堂，東京．
Nakashima T., Hirano S., Agata N., Kumagai H., Isshiki K., Yoshioka T,, Ishizuka M., Maeda K. and Takeuchi T.（1999） ：Inhibition of angiogenesis by a new isocoumarin, NM-3., J. Antibiotics, 52：426-428.
及川 勉（1995）：血管新生抑制剤開発，ファルマシア，31：1152-1154．
Oikawa T., Sasaki M., Inose M., Shimamura M., Kuboki H., Hirano S., Kumagai H., Ishizuka M. and Takeuchi T. （1997）：Effects of cytogenin, a novel microbial product, on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo., Anticancer Res. 17：1881-1886.
小山 則行，曲尾 直樹，山本 裕之，松井 順二，鶴岡 昭彦（2008）：新規血管新生阻害薬E7080の抗腫瘍効果，日薬理誌，132：100-104．
佐藤 靖史（1997a）：序論， 血管新生学（佐藤 靖史 編），p3-5，メディカルビュー社，東京．
佐藤 靖史（1997b）：2 固形腫瘍―腫瘍血管新生―，第3章 血管新生と病態， 血管新生学（佐藤 靖史 編），p95-108，メディカルビュー社，東京．
佐藤 靖史（1997c）： 5.血管新生， ��.炎症で見られる病態， 炎症と抗炎症戦略（室田誠逸， 柏崎禎夫 編），p94-103， 医薬ジャーナル社，東京．
佐藤 靖史（2006）：第14章 新規内因性血管制御因子Vasohibin，癌と血管新生の分子生物学（澁谷 正史 編），p148-158，南山堂，東京．
佐藤 靖史（2007）：血管内皮に備わっている血管新生制御の分子基盤，日薬理誌，129：163-166．
澁谷 正史（2006）：第3章 VEGFとその受容体による血管新生・透過性亢進の機序，癌と血管新生の分子生物学（澁谷 正史 編），p27-36，南山堂，東京．
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